Resumen de Tesis de Doctorado en Ciencias Biomédicas

"GENOTOXICIDAD INDUCIDA POR LA CIPERMETRINA EN LA RETINA DEL PEZ CEBRA (Danio rerio)”"

Autor: Paravani Enrique Valentín
Director: Dr. Victor Hugo Casco
Jurado: Doctores: Emilio Navarini, Gisela Poletta y Carolina Sasal
Fecha presentación: 27 de marzo de 2017

Dando continuidad a las investigaciones del grupo en las que se probaron los efectos apoptóticos de la cipermetrina sobre el sistema nervioso central (SNC) premetamórfico y larval de los anfibios anuros Rhinella arenarum y Physalaemus biligonigerus, se seleccionó la retina de los peces cebra adultos, una estructura derivada del sistema nervioso central durante la embriogénesis temprana de vertebrados, para profundizar los estudios in vivo de sus efectos, en un sistema muy bien caracterizado de células neurales. Se realizaron bioensayos de laboratorio, empleando dosis subletales de cipermetrina, inferiores a las encontradas en los cuerpos de agua de los agroecosistemas de Argentina. En paralelo, como órgano de referencia, se emplearon las branquias de peces cebra sometidos al mismo tratamiento.
Una vez establecida la curva de supervivencia de los animales tratados con cipermentrina, los estudios comprendieron análisis histológicos y de inmunofluorescencia de las retinas para verificar sus posibles efectos apoptóticos. Adicionalmente, para evaluar su posible efecto genotóxico, se realizaron análisis de ensayo cometa (EC), de actividad de las enzimas antioxidantes catalasa (CAT) y superóxido dismutasa (SOD), así como el análisis de las modificaciones en los niveles de expresión génica de dichas enzimas tanto en células retinianas como en el órgano de referencia.
Se probó que la cipermetrina tiene la capacidad de inducir una marcada toxicidad sobre los peces cebra con concentraciones de 0,6 µg/L, alcanzando valores de mortalidad del 50% a los quince días de exposición. Mediante los estudios histológicos se determinó que a partir del noveno día de tratamiento con la máxima concentración del piretroide, se comienzan a verificar procesos apoptóticos fundamentalmente en la lámina de las células fotorreceptoras, así como el adelgazamiento de la capa nuclear interna (células amácrinas, bipolares y horizontales) y alteraciones en la capa plexiforme externa. Los estudios de inmunofluorescencia, permitieron corroborar los hallazgos histológicos, mostrando que existen al menos dos tipos celulares retinianos que exhiben una sensibilidad diferencial al piretroide. Las células fotorreceptoras aparecen como altamente proclives a sufrir procesos de muerte celular por apoptosis, mostrando señal inmunofluorescente para caspasa-3, mientras que las células de la capa nuclear interna muestran señal para ?-H2AX, sugiriendo la existencia de daño oxidativo, aun cuando no se evidencian células apoptóticas en los períodos evaluados.
Comparado con las evidencias morfológicas halladas en la primera etapa del estudio, el EC, mostró una mayor sensibilidad para la detección de cambios cuantificables en el daño del ADN de las células retinianas de los animales tratados. En dicho ensayo se observó que con la menor concentración (0,3 ?g/L), el índice de daño del ADN (ID) muestra diferencias significativas a partir del noveno día del bioensayo, mientras que con 0,6 ?g/L todos los estadios evaluados mostraron diferencias muy significativas respecto de sus controles, así como entre todos los períodos evaluados. Un comportamiento similar exhibió el tejido branquial usado como referencia, aunque en este caso, la sensibilidad fue aún mayor ya que en este órgano ambas concentraciones mostraron diferencias muy significativas en todos los períodos evaluados y en relación con sus respectivos controles.
Los estudios de la actividad de las enzimas antioxidantes muestran que, en la retina, CAT exhibe diferencias estadísticamente muy significativas respecto a sus controles a partir del tercer día de tratamiento con 0,3 ?g/L, aunque no se verifican diferencias entre los distintos períodos evaluados. En los animales tratados con 0,6 ?g/L se mantienen las diferencias muy significativas respecto a sus controles en todos los períodos, pero a partir del noveno día de tratamiento, las diferencias entre grupos se extienden a todos los tiempos analizados. Un comportamiento semejante se verifica en las branquias de los animales tratados con ambas concentraciones de cipermetrina, aunque como en el EC, la sensibilidad resulta mayor a la observada en las células retinianas. Por el contrario, no se verificaron cambios de la actividad enzimática de SOD en los animales tratados con 0,3 ?g/L de cipermetrina, en ninguno de los períodos evaluados. En los bioensayos con 0,6 ?g/L el perfil de actividad enzimática de SOD posee semejanzas con el observado para CAT, a partir del sexto día de tratamiento. Para esta enzima, los perfiles de actividad en branquias muestran una respuesta incremental también a partir del sexto día del bioensayo, con diferencias significativas tanto respecto a sus controles como entre los distintos períodos de tiempo analizados.
Los estudios de cuantificación de los niveles de expresión de los genes que codifican estas enzimas fueron realizados en los extremos del bioensayo (tres y doce días) y sólo con 0,6 ?g/L. En consonancia con los hallazgos de actividad enzimática en retina, mientras que CAT mostró diferencias estadísticamente significativas en los dos períodos analizados, SOD no mostró cambios significativos a los tres días, incrementándose significativamente en el decimo segundo día del ensayo. Por el contrario las branquias mostraron diferencias significativas dependientes del tiempo, en relación con sus respectivos controles. Los cambios en la actividad de estas enzimas en ambos órganos, sugieren que CAT sería la primera en actuar como mecanimo de defensa frente a la excesiva producción de EROs y se propone que su actividad intenta contrarestar el estrés oxidativo causado por la cipermetrina, mientras que SOD, se activa diferencialmente y más tardiamente en respuesta a la injuria. En retina esta enzima sólo comenzaría a actuar a partir del sexto día del bioensayo y con la mayor concentración empleada. En el caso de los niveles de expresión génica de SOD, no se determinaron cambios estadísticamente significativos, al tercer día del bioensayo, escenario que se
Tesis de Doctorado en Ciencias Biomédicas. IUNIR – Lic. Enrique Valentín Paravani
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modifica significativamente en los animales tratados durante doce días, en los que se obtuvieron niveles superiores a los verificados para CAT. En el órgano de referencia, los perfiles de expresión génica son semejantes a los verificados en retina.
Los resultados obtenidos en esta tesis constituyen un aporte clave en relación con los posibles efectos de la cipermetrina sobre las células retinianas de vertebrados acuáticos. A la luz de los resultados obtenidos, se postula que los procesos apoptóticos desencadenados por el piretroide serían la combinación de los daños (diretos o indirectos) sobre el ADN causado por la excesiva producción de EROs y consecuente generación de estrés oxidativo que conduciría a desencadenar mecanismos diferenciales de muerte celular.
Los bioensayos realizados en la presente tesis, realizados sobre un modelo in vivo y bajo condiciones controladas de laboratorio, son importantes para reforzar las alertas sobre las potenciales consecuencias que tendría el excesivo empleo de la cipermetrina sobre los ecosistemas acuáticos, incluso con el uso de concentraciones inferiores a las verificadas en los estudios de campo de los cuerpos de agua próximos a los agroecosistemas de nuestro país.